vWF III位点扩增片段长度多态性试验
2013年11月25日   作者:管理员   阅读次数:304

【实验原理】
扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphisms,Amp-FLP)根据PCR技术原理,针对靶基因座的侧翼序列设计一对特异性引物,采用适当的PCR 反应体系和热循环条件,可扩增出该基因座等位基因。PCR 产物经电泳分离、显带后,杂合子为两条长度不等的片段,纯合子为一条片段。根据片段长度判定等位基因和基因型。
vWF III
位点是以TCTA 四个核苷酸为重复单位的短串联重复位点,位于vWF 基因第40内含子中。
【实验仪器】
Ependoff
管、微量加样器、台式离心机PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽
易生物仪器库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
【实验试剂】
1.
引物(10umol/L 2.Taq DNA 聚合酶0.5U/ul
3.10× buffer 4.dNTP
(每种25mM
5.
无菌去离子水 6.液体石蜡
7.
聚丙烯酰胺母液(T30%,C5) 8.TEMED(四甲基乙二胺)
9.PAS
10%过硫酸铵) 10.TBE1X, 5X
11.
尿素
12.
上样缓冲液—0.25%溴酚蓝,0.25%二甲苯青,98%甲酰胺
13.
固定液—10%冰醋酸
14.
染色液—2g AgNO33ml 37%甲醛溶于2L 水中
15.
显色液—60g Na2CO33ml 37%甲醛,400ul 12%硫代硫酸钠溶于2L 水中
【实验方法】
一、 PCR 扩增
1 PCR
扩增体系:无菌去离子水 8.5ul
10X Buffer 2ul
引物1 2ul
引物2 2ul
dNTP 1.5ul
Taq
2ul
DNA
模板 2ul
总体系20ul(最后加模板),其中含有1.5mmol/L MgCl250mmol/L KCl10mmol/L Tris
•HCl
pH8.4),dNTP 187.5umol/LTaq DNA 聚合酶1U,引物各1.0umol/L,模板DNA 50100ng
2.PCR
扩增条件:94预变性35sec94变性45sec58退火和延伸4min30 次循环后于72继续保温8min

二、 PCR 扩增产物的检测
聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染:
凝胶制备: 聚丙烯酰胺母液(T=30%, C=5%) 4ml
5X TBE 4ml
尿 8.4g
加水至20ml, 配成终浓度T=30%, C=5%的工作液。在工作液中加入200ul PAS 20ul TEMED 充分混匀后迅速灌入凝胶模,水平放置30min 凝集后即制成聚丙烯酰胺凝胶。
电泳:将凝胶板置于电泳仪上,电极缓冲液为1X TBE,将加有15 体积上样缓冲液的PCR 扩增产物上样电泳,10W 电泳1h 左右停止电泳。
显谱: 200ml 固定液中固定30min
蒸馏
水洗3 次,每次3min
200ml
染色液中染色30min
蒸馏
水快速冲洗凝胶一遍(20s 以内)。
加入200ml 显色液,5min 左右显色。
加入10%冰醋酸终止显色,水洗后凝胶干燥保存。
三、结果判读与分析
根据片段长度判定等位基因和基因型。杂合子为两条长度不等的片段,纯合子为一条片段。

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