限制性片段长度多态性(RFLP)分析
2013年11月25日   作者:管理员   阅读次数:331

限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析技术是分子生物学的重要分析方法之一,用于检测DNA序列多态性。PCR-RFLP 是将PCR 技术、RFLP 分析与电泳方法联合应用,先将待
测的靶DNA 片段进行复制扩增,然后应用DNA 限制性内切酶对扩增产物进行酶切,最后经电泳分析靶DNA 片段是否被切割而分型。
本实验将应用RFLP 分析技术检测NMDA 受体中的GRIN2A 亚基基因3 号内含子中的2 SNP 位点rs17750303A→C)和rs837690A→G)。
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实验原理]
DNA 限制性内切酶
具有识别特定的DNA 序列并在特定的部位切断DNA 双链的活性功能,DNA 分子由于突变(核苷酸的置换、插入或缺失)改变(或形成)了限制性内切酶识别序列,使DNA 限制性内切酶不能(或可以)将靶DNA 片段切断,电泳检测时,存在相应DNA 限制性内切酶识别序列者原DNA 片段变成短片段;不
存在相应DNA 限制性内切酶识别序列者原DNA 片段长度将不发生变化。
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实验器材]
PCR
扩增仪、电泳仪、电泳槽、微波炉、恒温箱或恒温水浴等。
易生物仪器库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-42.html
易生物试剂库:http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html
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实验试剂]
限制性内切酶BstN I、模板DNATaq 聚合酶PCR 引物(上游引物:5CTAAGCCTTCCCTTTATCACC3’;下游引物:5TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT3’)、丙烯酰胺、酶消化缓冲液、电极缓冲液、上样缓冲液等。
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实验方法]
1.PCR
扩增:PCR 反应体系为20μl,含模板2μl(50ng),引物各1.6μldNTP1.6μl(0.4mM)10×Buffer 缓冲液2μlTaq 0.5U,加双蒸水至20.0μlPCR 反应条件为95℃2min94℃30sec/64℃30sec/72℃ 30sec(5
个循环)94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec(5 个循环)94℃30sec/60℃ 30sec/72℃ 25sec(23 个循环)94℃30sec/60℃30sec/72℃1min
2.PCR
扩增产物的检测:取PCR 扩增产物2μl,以1%琼脂糖凝胶潜水电泳法检测靶DNA 片段的扩增产物。
3.
酶消化反应:取PCR 产物约2.0μl,加限制性内切酶BstN I1U10×酶消化反应缓冲液1.0μl,蒸溜水补至10.0μl 置试验管中。37℃温箱中孵育4h
4.
酶切产物电泳分型:6%聚丙烯酰胺凝胶电泳(T=6%C=3.3%,凝胶规格为82mm×64mm×0.75mm)。电极缓冲液为1×TBE。将加有1/5 体积上样缓冲液的酶切产物电泳,220 v 电压,电泳23h
5.
银染显色将凝胶剥离至染色盘中,用10%冰醋酸固定30min,去除固定液,用蒸馏水冲洗凝胶3 次(2min 以内)。将0.1%硝酸银溶液200ml 倒入染色盘中,染色30min,倒掉染色液,蒸馏水快速冲洗凝胶1 次(20s 以内)。
显色液200ml3% Na2CO3,含0.05%甲醛,2‰Na2S2O3)倒入染色盘中,不断震荡,直至谱带显示清晰。用固定液终止显色。蒸馏水洗涤一次,贴于滤纸上晾干保存。
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结果判定]
本实验PCR 产物长度为379bprs17750303 位点位于140bp 处,为A/C突变。rs837690 位点位于175bp 处,为AG 突变。两个位点均为BstN I 酶识别部位,酶切后可以产生1-46 种)个DNA 片断,根据酶切片段数量与长度可出现10 种谱型(基因型组)见下表。
根据酶切片段数量与长度确定rs17750303rs837690 位点基因型组合
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GRIN2A 基因rs17750303 rs837690 位点的RFLP 电泳谱型
1.DNA
长度标准品;2.PCR 扩增产物;3.AA-AA 型;4.CC-AG 型;5.AC-AA,6.AC-GG 型,;7.CC-AA 型;8.CC-GG 型;9.AA-GG 型;10.CA-AG 型。
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实验讨论]
1.
注意事项靶片段的扩增产物要纯,如有非特异产物(特别是大片段可能含有酶识别序列)将竞争酶活性,使样品消化不完全或及出现酶消化杂带;酶消化过程要充分(即 底物与酶的比例要合适,消化时间要保证),避免假阴性结果;酶切阳性结果可以确定所检测具体序列,阴性结果仅可说明非酶识别序列,但不能准确判定具体序 列。酶识别序列如有甲基化之核苷酸将不被切割。
2.
方法评价 该方法操作简单,结果容易判定。

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